Estudos de viabilidade de endoscopia não linear multimodal usando feixes de fibras multicore para varredura remota de seções de tecido até órgãos em massa

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13779 (2023) Citar este artigo

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Aqui, relatamos o desenvolvimento e a aplicação de uma sonda óptica de fibra multinúcleo compacta para imagens não lineares multimodais, combinando as modalidades livres de rótulo de Dispersão Raman Anti-Stokes Coerente, Geração de Segunda Harmônica e Fluorescência Excitada por Dois Fótons. As sondas deste design de fibra multinúcleo evitam peças móveis e que transportam tensão na extremidade distal, proporcionando assim uma compatibilidade melhorada e promissora com os requisitos clínicos em relação às implementações concorrentes. As características de desempenho da sonda são estabelecidas usando secções criogênicas finas e alvos artificiais antes que a aplicabilidade a amostras clinicamente relevantes seja avaliada usando tecidos ex vivo de intestino humano e suíno. Após a reconstrução da imagem para neutralizar a natureza inerentemente pixelizada dos dados, as imagens gravadas mostram alta qualidade de imagem e conformidade morfoquímica no nível do tecido em comparação com imagens multimodais não lineares obtidas com um microscópio de varredura a laser usando uma objetiva de microscópio padrão. Além disso, um procedimento de reconstrução simples, mas eficaz, é apresentado e demonstra produzir resultados satisfatórios. Finalmente, é delineado um caminho claro para novos desenvolvimentos para facilitar a tradução da sonda de fibra multimodal em avaliação e aplicação clínica no mundo real.

A imagem in vivo de tecidos sem rótulo, fornecendo informações morfológicas e químicas, é crucial para muitas aplicações médicas previstas, particularmente para um exame histopatológico não invasivo intraoperatório de tecido. Nos últimos anos, foi demonstrado que a combinação de diferentes técnicas espectroscópicas em uma abordagem de imagem multimodal é benéfica para atender a todos os requisitos de velocidade, profundidade de penetração e especificidade molecular1,2,3. Uma dessas abordagens é a microscopia Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS), que co-gera simultaneamente os outros dois efeitos não lineares, Fluorescência Excitada por Dois Fótons (TPEF) e Segunda Geração Harmônica (SHG), em um único dispositivo de imagem. CARS permite mapear uma vibração molecular específica, sendo as escolhidas com mais frequência indicativas predominantemente de lipídios (por exemplo, ~ 2.855 cm-1, νs (CH2)) ou proteínas (por exemplo, ~ 2.930, νs (CH3)), ambos os quais são abundantes em amostras biológicas. Em contraste, o TPEF pode ser usado para tratar autofluoroforos endógenos, mais notavelmente o NAD(P)H, que é onipresente nos tecidos devido à sua importância para o metabolismo celular. Além disso, o SHG é um processo que ocorre apenas em materiais não centrossimétricos, tornando-o altamente específico para biomateriais quase cristalinos, como fibras de colágeno ou filamentos de miosina. Assim, a combinação dessas três modalidades não lineares fornece informações valiosas sobre a morfoquímica de um tecido de maneira livre de rótulos.

Neste contexto, demonstramos que a microscopia não linear multimodal combinando CARS, SHG e TPEF permite a detecção de estruturas características e as alterações moleculares que as acompanham de doenças generalizadas, particularmente o câncer . Para facilitar a interpretação dos dados de imagem CARS/SHG/TPEF, algoritmos avançados de processamento de imagem podem extrair automaticamente propriedades características6,7. Além disso, e juntamente com a avaliação automática, pode ser demonstrado que a informação codificada nestas imagens multimodais gravadas livremente também pode ser traduzida em imagens computacionais de hematoxilina e eosina (H&E)8 através de estatísticas multivariadas, que não só exploram o corpo existente de conhecimento e formação de profissionais médicos, mas também pode ajudar na aceitação transitória. Para gerar tais imagens computacionais de H&E e/ou fornecer uma avaliação automatizada de dados de imagens não lineares multimodais - incluindo classificação de doenças ou segmentação visual como base para tomadas de decisões clínicas adicionais - no local e diretamente durante a cirurgia, dispositivos endoscópicos portáteis compactos é requerido. Com cenários de aplicação que vão desde a detecção de margens tumorais em feridas cirúrgicas até a investigação de sintomas e detecção, classificação e monitoramento de doenças em órgãos ocos (por exemplo, doença inflamatória intestinal9), o desenvolvimento de dispositivos endoscópicos para imagens espectroscópicas não lineares tem sido um assunto de interesse significativo. por muitos anos. Diferentes abordagens foram apresentadas: além das sondas de varredura pontual10, as mais comuns são endoscópios de fibra de varredura11,12,13,14,15,16,17,18 e uso de espelhos de varredura galvo ou scanners de sistema microeletromecânico (MEMS)19,20,21, 22,23,24.

90%) in the wavelength range of 400–780 nm. The GRIN lense and DOE assembly was manufactured to stricter tolerances, minimizing vignetting and chromatic errors of the pump and Stokes beams. Additionally, the probe head was refined with a new metal housing to protect and enforce the otherwise fragile fiber connection. For the same reason, Medical Device Regulation (MDR) approved endoscope tubes and SMA connectors were applied to the fibers. A home-built LSM has been used for coupling the excitation laser pulses generated by an 80 MHz mode-locked Nd:VAN laser (picoTRAIN, High Q Laser, Austria) in combination with an optical parametric oscillator (Levante Emerald, A.P.E, Germany) at 816 nm (pump) and 1064 nm (Stokes) into the imaging fiber34. This wavelength pair corresponds to a Raman resonance of 2850 cm−1, matching the symmetrical stretching vibration of CH2 groups particularly abundant in lipids, which results in a CARS signal at 661.8 nm. As excitation wavelength for the SHG modality, we used the 1064 nm beam, while both beams served as the excitation source for the TPEF modality. The proximal end of the imaging fiber is placed in the focal plane of the LSM where it is scanned by two galvo mirrors in a dense raster pattern, while the distal end of the probe is placed at the tissue sample. The full image circle diameter measures ~ 460 µm, however, a reduced scanning field (~ 260 µm) in the central region of the imaging fiber is used to avoid damaged cores in the fiber, which might have been caused during the manufacturing process of the probe head. The power of the laser beams at the sample site was about 50 mW for pump and 25 mW for Stokes in the probe measurement and 70 mW for pump, and 40 mW for Stokes in LSM recordings. The average laser power used for nonlinear endoscopic imaging provided sufficient signal generation from the presented samples without causing visible damage to any of them and aligns with the power scales utilized in comparable nonlinear endoscopic imaging applications18,35 with use of picosecond laser pulses. A useful point of reference in this context is provided by Galli et al.36 who investigated photodamage under similar excitation conditions as a function of recorded frame repetitions. A schematic setup of the LSM coupled to the probe is depicted in Fig. 1a. Figure 1b shows the internal optical design of the probe head. Two notch dichroic beamsplitters (NFD01-532 (Semrock, USA) and F73-067 (Chroma, USA)), and three bandpass filters (FF01-661/20 (Semrock, USA), FL532-10 (Thorlabs, USA) and FF01-550/88 (Semrock, USA)) were used in addition to a short-pass filter (FESH0700, Thorlabs, USA) to separate sample signals. In the current design iteration, all optics are designed for a measurement through 170 µm of glass. For easier prototyping and more versatility in the testing phase, the current design does not include a fixed glass window and instead relies on a cover glass to be placed on the sample. The probe design is largely agnostic to the specific LSM used and could, for example, be coupled with a compact fiber-based laser system and scan head to be incorporated into a mobile station, as demonstrated recently for a rigid-body nonlinear endoscope35. An overview of key structural and performance characteristics of the probe is given in Table 1./p>